关于培养细胞样品:
1. 融解RIPA裂解液,混匀。取恰当量的裂解液,在运用前数分钟内参加PMSF,使PMSF的*终浓度为1mM。
2. 关于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(假如血清中的蛋白没有搅扰,能够不洗)。依照6孔板每孔参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充沛触摸。一般裂解液触摸细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。
关于悬浮细胞:离心搜集细胞,用手指把细胞用力弹散。依照6孔板每孔细胞参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。再用手指轻弹以充沛裂解细胞。充沛裂解后应没有显着的细胞沉淀。假如细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。
3. 充沛裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
裂解液用量阐明:一般6孔板每孔细胞参加150微升裂解液现已足够,但假如细胞密度十分高能够恰当加大裂解液的用量到200微升或250微升。
关于安排样品:
1. 把安排剪切成细微的碎片。
2. 融解RIPA裂解液,混匀。取恰当量的裂解液,在运用前数分钟内参加PMSF,使PMSF的*终浓度为1mM。
3. 依照每20毫克安排参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。(假如裂解不充沛能够恰当增加更多的裂解液,假如需求高浓度的蛋白样品,能够恰当削减裂解液的用量。)
4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充沛裂解。
5. 充沛裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6. 假如安排样品自身十分细微,能够恰当剪切后直接参加裂解液裂解,经过激烈vortex使样品裂解充沛。然后同样离心取上清,用于后续试验。直接裂解的长处是比较便利,不用运用匀浆器,缺陷是不如运用匀浆器那样裂解得比较充沛。
注:RIPA裂解液的裂解产品中经常会呈现一小团通明胶状物,属正常现象。该通明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别严密的蛋白的情况下,能够直接离心取上清用于后续试验;假如需求检测和基因组结合特别严密的蛋白,则能够经过超声处理打碎打散该通明胶状物,随后离心取上清用于后续试验。假如检测一些常见的转录因子,例如NF-kappaB、p53等时,一般不用进行超声处理,就能够检测到这些转录因子。
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