ELISA是什么检测方法？一文带你了解ELISA类型与方法

 　　ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验室免疫测定方法，用于检测和定量各种生物样本（例如血清、血浆、尿液、组织匀浆、细胞培养上清液等）中的目标物质，例如蛋白质、肽、激素、抗体、等。

　　在ELISA检测中，其核心原理是利用抗原抗体之间的特异性结合，以及酶的催化放大作用，来检测和定量目标物质。抗原或抗体会被吸附到固相载体上，然后通过一系列的孵育和洗涤步骤，最终通过酶催化底物显色来实现检测。

　　ELISA检测阶段：

　　包被/捕获：包被步骤的目的是将能够特异性结合待测分子的物质固定在96孔板表面。如果待测分子是抗原，则使用捕获抗体进行包被；如果待测分子是抗体，则使用抗原进行包被。

　　板封闭：在包被步骤之后，使用封闭液覆盖96孔板的剩余表面，以阻断非特异性结合位点，从而降低背景信号并提高信噪比。常用的封闭剂包括牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、酪蛋白和明胶等。选择合适的封闭剂取决于具体的ELISA体系和待测物质，需要进行优化以避免干扰抗原抗体反应。

　　检测：将待测抗体加入到包被有抗原的ELISA板中孵育，然后洗涤。接下来，加入酶标记的二抗，该二抗能够特异性地结合待测抗体。孵育后洗涤，最后加入底物显色，通过颜色深浅判断待测抗体含量。

　　信号测量：使用平板读取器读取目标抗原和抗体之间反应产生的信号量。获得的数据可以是定量的、半定量的和定性的。在定量研究中，浓度结果与标准曲线作图，将光密度与对数浓度进行比较。

　　ELISA类型

　　直接ELISA

　　直接ELISA法将抗原固定在聚苯乙烯微孔板，然后使用蛋白质（牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、酪蛋白和明胶）封闭未结合的位点，孵育后洗涤。

　　在该检测中，一抗是直接偶联了酶的，加入底物，酶催化底物显色，通过颜色深浅判断抗体含量。由于步骤较少，直接ELISA是一种快速的实验室工作流程技术，还可消除二抗交叉反应。缺点是反应明敏度低且成本较高。

　　间接ELISA

　　间接ELISA与直接ELISA在包被、封闭和显色步骤上相似，主要区别在于检测方式。间接ELISA使用两种抗体：未标记的特异性一抗和酶标记的二抗。

　　将抗原固定在聚苯乙烯微孔板，然后使用蛋白质（牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、酪蛋白和明胶）封闭未结合的位点。加入待测抗体（一抗），孵育后洗涤，然后加入酶标记的二抗（例如HRP或AP标记的抗人IgG抗体），该二抗能够特异性地识别一抗。孵育后洗涤。

　　加入底物，酶催化底物显色，通过颜色深浅判断抗体含量。

　　间接ELISA的优点是成本较低，灵敏度更高。但是由于二抗，在检测过程可能会发生交叉反应。

　　夹心elisa

　　夹心ELISA用于检测抗原，其原理是将抗原“夹”在捕获抗体和检测抗体之间。首先，将捕获抗体包被在微孔板表面。捕获抗体能够特异性地结合待测抗原上的一个表位。包被后，使用封闭液（例如BSA）封闭未结合的位点，以减少非特异性结合。孵育后，充分洗涤微孔板。然后，将待测抗原加入微孔板中，并孵育一段时间（例如37°C，1-2小时，具体时间需要优化）。孵育后，再次充分洗涤微孔板，以去除未结合的抗原。接下来，加入酶标记的检测抗体，该抗体能够特异性地结合待测抗原上的另一个表位。孵育后，再次充分洗涤微孔板，以去除未结合的检测抗体。最后，根据酶标记的类型选择合适的底物（例如，HRP常用的底物是TMB）。加入底物后，酶催化底物显色，使用酶标仪读取吸光度值，并根据标准曲线计算抗原浓度。

　　夹心ELISA法灵敏度高，但其主要缺点是检测过程耗时费力。此外，需要找到完美的抗原抗体对也是该检测法的一个限制。

　　竞争法ELISA

　　竞争法ELISA用于检测样本中是否存在抗原特异性抗体。其原理是待测抗体与酶标记的抗体竞争结合有限数量的抗原。

　　将抗原固定在聚苯乙烯微孔板，然后使用蛋白质（牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、酪蛋白和明胶）封闭未结合的位点。 将待测抗体和酶标记的抗体（竞争抗体）混合后加入微孔板中。待测抗体和竞争抗体竞争结合包被在板子上的抗原。孵育洗涤。加入底物，酶催化底物显色，颜色越深，表示待测抗体含量越低；颜色越浅，表示待测抗体含量越高。通过与标准曲线比较，可以定量测定待测抗体的浓度。

　　该方法不适用于经过任何程度稀释的样本，灵敏度较低。但是，该方法具有许多优点，例如，对样本纯化的要求较低、变异性较小，并且可以分析样本中的多种抗原。

　　常见ELISA检测方法

　　目前有许多检测方法来研究抗原抗体复合物之间的反应，例如比色法、荧光法、化学发光法和显色法。但下面介绍其中最常见的三种方法。

　　化学发光分析

　　该技术利用过氧化物酶偶联检测抗体，如HRP和AP。以鲁米诺溶液为底物，形成反应产物，发射出可见光子，然后用光度计读取。

　　与其他检测方法相比，该技术超灵敏，动态范围更广，甚至可以检测到给定样本中最少量的分析物。

　　显色测定

　　显色法是最常见的ELISA检测方法之一。它涉及使用辣根过氧化物酶(HRP-)或碱性磷酸酶(AP-)标记的抗体与显色底物（例如四甲基联苯胺(TMB)溶液）结合使用。

　　该技术利用反应的吸光度来确定读数，用于比较样品或根据标准曲线检测感兴趣分子的浓度。

　　荧光分析

　　该技术将过氧化物酶偶联检测抗体（如HRP和AP）与荧光底物相结合，后者在暴露于特定光波长时会发出荧光。即使在分析物浓度较高的情况下，信号也不会饱和，从而提供更准确的结果。

　　通过本文elisa是什么检测方法介绍，对ELISA检测方法有所认识。认识ELISA检测方法，对于日后ELISA实验检测至关重要。希望本文内容能够帮助您在未来实验取得更大的成功。