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elisa底物显色原理

ELISA是一种广泛应用于生命科学和生物化学实验室的酶联免疫吸附测定实验，用于定性和定量检测各种生物分子，例如蛋白质、抗体、肽、糖蛋白和激素。   　　在ELISA实验中，目标抗原或抗体会被固定在聚苯乙烯微孔板上。然后，加入酶标记的抗体（或抗原，取决于ELISA类型）与目标物质进行特异性结合，并在孵育后形成复合物。未结合的试剂通过洗涤步骤去除。<o:p></o:p>   　　最后，加入特定的底物，酶催化底物反应，产生可检测的颜色变化或荧光/发光信号。通过测量这些信号，可以定量或定性分析目标物质的浓度。ELISA实验有多种类型，例如双抗体夹心法、间接法、竞争法等，每种类型都有其特定的操作步骤和应用场景。<o:p></o:p>   　　ELISA实验中，在洗涤去除未结合的酶标记物后，将含有反应结合物的ELISA板与合适的底物一起孵育。底物的选择取决于与抗体偶联的酶的类型，例如辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶(AP)。酶催化底物反应，产生可检测的颜色变化、荧光或发光信号，从而放大信号并可视化板中发生的反应。<o:p></o:p>   　　ELISA实验中的一些常用底物是过氧化氢、鲁米诺和对硝基苯基磷酸盐(pNPP底物)。在本文中为大家详细介绍下这些底物在ELISA实验过程作用方式、它们功能及其在不同医学和生物技术实验室和行业中的应用。<o:p></o:p>   　　在ELISA反应体系中，酶标记的抗体（或抗原）与目标抗原（或抗体）结合后，加入相应的底物。酶会催化底物发生化学反应，产生可检测的信号，例如颜色变化、荧光或电化学信号。这些信号的强度与样本中目标抗原（或抗体）的浓度成正比。可以使用分光光度计、荧光计或电化学检测器等仪器测量这些信号，从而定量样本中目标物质的含量。<o:p></o:p>   　　不同的底物在与酶发生氧化反应时会产生不同的颜色。例如，辣根过氧化物酶底物与HRP酶反应后会产生以下结果：<o:p></o:p>   <ul> <li>　　ABTS（2,2′-联苯二胺[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐）：绿色<o:p></o:p></li> <li>　　TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯胺）：橙色<o:p></o:p></li> <li>　　OPD（邻苯二胺）：蓝色<o:p></o:p></li> </ul>   　　产生的颜色量或获得的信号与结合固定在96孔板表面的抗原的一抗的量成正比。   <o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/1(84).png" width="500" height="156" alt="" />   　　为了获得高质量、一致且可靠的蛋白质测量结果，许多科研人员选择使用<a href="/category-1-b0.html">ELISA</a><a href="/category-1-b0.html">试剂盒</a>。这些试剂盒提供了进行特定ELISA检测所需的核心试剂，简化了操作步骤，缩短了实验时间。相比于自行配制试剂，使用试剂盒通常可以减少实验变异性，并提高实验的重现性。优质的ELISA试剂盒通常具有较高的灵敏度和批次间一致性。然而，不同品牌的试剂盒性能可能存在差异，研究人员应根据具体实验需求选择合适的试剂盒，并在实验前仔细阅读说明书。部分情况下，仍可能需要自行配制或优化某些试剂。<o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/1 - 副本.jpg" alt="酶联生物ELISA试剂盒" width="400" height="300" /> <h3>　　ELISA底物类型<o:p></o:p></h3>   　　根据所使用检测方法，ELISA底物可分以下几大类：<o:p></o:p>   　　化学发光底物<o:p></o:p>   　　报告酶-底物反应产生的光被用作化学发光检测系统的信号。HRP酶使用的化学发光底物溶液包括鲁米诺。AP酶需要1,2-二氧杂环丁烷类试剂来产生信号，该信号可被X射线胶片或电荷耦合器件(CCD)相机捕获。<o:p></o:p>   　　为了增加化学发光信号的强度、持续时间和灵敏度，检测过程中也使用增强化学发光底物(ECL)。但应对底物进行稀释，以防止产生假高强度信号。<o:p></o:p>   　　显色底物<o:p></o:p>   　　这些底物与报告酶反应生成有色的不溶性反应产物，可用分光光度计检测。该方法中使用的HRP底物包括2'-连氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）；5-氨基水杨酸（5-AS）；3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）；和邻苯二胺（OPD）。<o:p></o:p>   　　AP酶的底物是5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）和硝基蓝四唑（NBT）。通过使用终止液可以增强所产生的比色信号，从而获得更准确的信号测量结果。<o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/显色底物.png" alt="显色底物" width="400" height="459" /> 　　荧光底物<o:p></o:p>   　　荧光ELISA底物需要荧光计来产生正确的激发光束，使荧光标签发出信号。荧光计通过其激发和发射滤光片测量信号。<o:p></o:p>   　　ELISA检测中使用的荧光AP底物是4-MUP（4-甲基伞形酮磷酸酯），其在发射波长为440nm和激发波长为360nm时产生信号。HPPA（3-对羟基苯基丙酸）和HPA（羟基苯乙酸）底物与过氧化物酶配对。<o:p></o:p>   　　为ELISA检测选择合适的底物取决于灵敏度（检测下限或上限）、时间要求以及过程中所需/使用的检测设备类型。 <img src="/images/upload/Image/荧光底物.png" alt="荧光底物" width="400" height="402" /><o:p></o:p>   <h3>　　Elisa底物有何用途？<o:p></o:p></h3>   　　ELISA底物对于ELISA检测、扩增和量化信号至关重要。它们与酶发生反应，产生有色产物或信号，可使用合适的设备进行测量。<o:p></o:p>   　　ELISA是一种生化检测方法，用于识别和量化生物分子，例如蛋白质、肽、糖蛋白和激素。ELISA板含有抗原抗体（与荧光团或酶结合）复合物的反应混合物，与合适的底物一起孵育，以进行反应可视化，这是ELISA的最后一步。<o:p></o:p>   　　底物与HRP或AP酶发生反应，产生不溶性有色反应产物或信号，通过分光光度计或荧光分光光度计进行测量。<o:p></o:p>   　　为ELISA选择正确底物是实验成功关键步骤之一。为您的ELISA实验选择合适的底物，最大限度地提高实验的准确性和可靠性！<o:p></o:p>

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