ELISA检测方法步骤

 　　ELISA是一种用于检测和定量蛋白质、抗体、抗原的免疫学方法，广泛应用于生物医学研究和诊断中。然而，对于刚接触ELISA新手来说，复杂的实验步骤和细节常常让他们感到困惑。接下来，我们将逐步讲解ELISA的操作步骤。

　　实验步骤

　　 一、实验试剂准备

　　1.抗原/抗体:根据实验目的和ELISA类型(例如夹心法、间接法、竞争法)，选择合适的抗原或抗体。

　　2.96孔板:高结合力的聚苯乙烯微孔板，用于吸附抗原或抗体。

　　3.酶标二抗:与目标抗体/抗原结合的酶标二抗，例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的二抗。

　　4.封闭液:用于封闭微孔板未结合位点，减少非特异性结合。常用5%BSA（牛血清白蛋白）PBS溶液或脱脂奶粉PBS溶液。

　　5.酶底物:用于与酶标二抗上的酶反应，产生可检测的信号。HRP常用TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺），AP常用pNPP（对硝基苯磷酸）。

　　6.酶反应终止液:用于终止酶促反应。HRP常用2N硫酸溶液。

　　7.洗涤液:用于洗涤未结合的抗体或抗原，常用0.05%PBST(PBS溶液+0.05%Tween20)。

　　8.样品稀释液:根据样品的不同，选择合适的稀释液。

　　9.标准品(可选):如果需要进行定量分析，则需要准备一系列已知浓度的标准品，用于绘制标准曲线。

　　二、实验步骤

　　1.包被抗体/抗原

　　配制合适浓度的抗原或抗体（通常1-10µg/mL），浓度需要通过预实验进行确定。用碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释。

　　向96孔板中每孔加入合适的体积（例如50-200µ）稀释好的抗原或抗体溶液。

　　在4°C或37°C孵育过夜或2小时，让抗原/抗体吸附到板子上。孵育时间和温度需要根据具体情况进行优化。

　　三、洗板

　　用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗板，重复以下步骤3-5次，或根据需要增加洗涤次数，以确保充分去除未结合的物质：

　　①、弃去孔内液体。

　　②、用足量的洗涤液(例如200-300µL/孔)充满每孔。

　　③、静置1-2分钟。

　　④、弃去洗涤液，并用吸水纸小心拍干板子，避免交叉污染。

　　四、封闭

　　每孔加入200µL封闭液，例如1%-5%BSA或脱脂奶粉的PBS/PBST溶液。在室温下孵育1-2小时，或4°C过夜孵育。孵育结束后，进行洗板操作：

　　①、弃去孔内液体。

　　②、用洗涤液(例如0.05%PBST)注满每孔。

　　③、静置1-2分钟。

　　④、弃去洗涤液，并用吸水纸小心拍干板子，避免交叉污染。重复洗板步骤3-5次。

　　五、加样品或标准品

　　使用样品稀释液或标准品稀释液（通常与封闭液成分相同）按照合适的稀释梯度（例如2倍、3倍、5倍等）稀释待测样品或标准品。对于定量ELISA，需要准备一系列已知浓度的标准品，并进行梯度稀释，用于绘制标准曲线。

　　每孔加入100µL稀释后的样品或标准品。设置空白对照孔，不加样品或标准品，只加稀释液。

　　在室温下孵育1-2小时，或37°C孵育30-60分钟。孵育时间和温度需要根据具体的抗原抗体进行优化。

　　六、加检测抗体（对于夹心法）

　　孵育完样品后，进行洗板操作：

　　①、弃去孔内液体。

　　②、用洗涤液(例如0.05%PBST)充满每孔。

　　③、静置1-2分钟。

　　④、弃去洗涤液，并用吸水纸小心拍干板子，避免交叉污染。重复洗涤步骤3-5次。

　　⑤、加入用抗体稀释液(通常与封闭液成分相同)稀释好的检测抗体(结合靶标抗原的酶标抗体)，每孔100µL。抗体的稀释倍数需要根据具体的抗体和实验条件进行优化。

　　⑥、在室温或37°C下孵育1-2小时。具体孵育时间和温度需要根据具体的抗体进行优化。

　　⑦、孵育结束后，再次进行洗板操作(步骤同上)。

　　七.加酶标二抗

　　使用抗体稀释液（通常与封闭液成分相同）稀释酶标二抗。加入稀释好的酶标二抗（结合检测抗体的酶标抗体），每孔100µL。二抗的稀释倍数需要根据具体的抗体和实验条件进行优化。

　　在室温或37°C下孵育30分钟至1小时。具体孵育时间和温度需要根据具体的二抗进行优化。

　　孵育结束后，进行洗板操作：

　　①、弃去孔内液体。

　　②、用洗涤液(例如0.05%PBST)充满每孔。

　　③、静置1-2分钟。

　　④、弃去洗涤液，并用吸水纸小心拍干板子，避免交叉污染。重复洗板步骤3-5次。

　　八.加底物反应

　　根据试剂盒说明书准备酶底物溶液。加入100µL酶底物溶液（如TMB）到每孔，避光反应一段时间，通常为5-30分钟，或直至出现明显的颜色变化(例如，对于TMB底物，颜色会从无色变为蓝色)。密切观察显色情况，并根据试剂盒说明书和标准品的显色情况来确定反应时间。

　　九.终止反应

　　根据试剂盒说明书加入终止液，以终止反应，停止底物显色反应。颜色变化取决于所使用的底物。例如，使用TMB底物时，加入2N硫酸后，颜色会从蓝色变为黄色。

　　十.测定吸光值

　　使用已校准的酶标仪，根据试剂盒说明书选择合适的检测波长和参考波长，读取各孔的吸光值（OD值）。读取吸光值后，需要对数据进行分析，例如绘制标准曲线、计算样品浓度等。

　　实验注意事项：

　　1.重复性：进行足够的重复实验，例如至少三个技术重复（同一份样品在同一块板上进行三次测定）或三个生物学重复（三个不同的样品分别进行测定）。技术重复可以评估实验的精确度，而生物学重复可以评估实验的重复性。

　　2.温度控制：在孵育阶段，温度对结果的影响较大。建议使用培养箱进行孵育，以获得更精确的温度控制。如果在室温下孵育，则尽量保持稳定的室温，避免较大的温度波动。

　　3.洗涤：每次洗板时，确保洗涤液完全覆盖每个孔。洗涤时，可以轻轻拍打板子边缘，以去除残留液体，或使用洗板机进行洗涤。注意避免交叉污染。

　　4.显色时间控制：显色反应时间对结果有很大影响。密切观察显色情况，并根据试剂盒说明书和标准品的显色情况来确定最佳反应时间。当标准品孔出现明显的梯度颜色变化时，即可终止反应。

　　5.试剂质量：使用高质量的试剂对于获得可靠的实验结果至关重要。

　　6.操作规范：严格按照操作规程进行实验，避免人为误差。

　　7.标准曲线：对于定量ELISA，标准曲线的质量直接影响样品浓度的计算结果。确保标准曲线线性良好，并选择合适的拟合方法。

　　上述是ELISA检测方法步骤，ELISA实验操作包括包被、封闭、加样、洗板、显色等多个步骤。实验完成后，通过标准曲线拟合和计算，可以准确获得样品中的目标分子浓度。在实验中要注意些事项。关于标准曲线拟合和计算，下篇文章继续为您介绍。