细胞冷冻保存的具体操作步骤

细胞冷冻保留的具体操作过程

依据技术部给出的最新细胞冷冻保留办法，现公布于下：

1. 注意事项：

1.1. 欲冷冻保留之细胞应在成长杰出(log phase) 且存活率高之状况，约为80 – 90 %致密度。

1.2. 冷冻前检查细胞是不是仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保留前一至二日测验是不是有抗体之发生。

1.3. 留意冷冻保护剂之质量。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micronFGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌商品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4℃避光保留，勿作多次冻结。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保留。在敞开后一年内运用，因长时间贮存后对细胞会有毒性。 1.4. 冷冻保留之细胞浓度：

1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在冻结24 小时后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞品种而异。Adenocarcinoma 冻结后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 须最少5 x 106cells/ml。

1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 % DMSO，如果不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保留之一起，亦应作一个backup culture，以避免冷冻失利。

1.6. 冷冻办法： 1.6.1. 传统办法: 4℃ 10 分钟---> -20℃ 30 分钟---> -80℃ 16 - 18 小时(或过夜) ---> 液氮槽vapor phase 长时间贮存。 1.6.2. 程序降温：运用等速降温机以–1 ～ -3℃/分钟之速度由室温降至–120℃，放在液氮槽vapor phase 长时间贮存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保留。

细胞冷冻保留

2. 资料： 2.1. 成长杰出之培育细胞 2.2. 新鲜培育基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 无菌塑料冷冻保留管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球计数盘与盖玻片 2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)

3. 过程： 3.1. 冷冻前一日前替换半量或全量培育基，调查细胞成长景象。 3.2. 制造冷冻保留溶液(运用前制造)：将DMSO 参加新鲜培育基中，最终浓度为5-10%，混合均匀，置于室温下待用。 3.3. 依细胞继代培育之操作，搜集培育之细胞，取少数细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。

3.4. 离心，去掉上清液，参加适量冷冻保留溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标明彻底之冷冻保留管中，1 ml/vial，并取少数细胞悬浮液作污染检查。 3.5. 冷冻保留办法1: 冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16～18 小时(或过夜) → 液氮槽vapor phase 长时间贮存。 3.6. 冷冻保留办法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。

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