因此在运用一步法ELISA试剂盒测定标本中含量可反常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应留意可测规模的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
倘若在被测分子的不同位点上富含多个一样的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶联系物。但在HBsAg的检查中应留意亚型疑问,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,尽管每种亚型均有一样的a决定簇的反响性,这也是用单抗作夹心法应留意的疑问。
ELISA试剂盒双抗体夹心法测抗原的另一留意点是类风湿因子(RF)的搅扰。RF是一种本身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段联系。血清标本中如富含RF,它可充任抗原成份,一起与固相抗体和酶标抗体联系,表现出假阳性反响。选用F(ab')或Fab片段作酶联系物的试剂,因为去掉了Fc段,然后消除RF的搅扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项查核目标(拜见6.2)。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能构成两位点夹心。直接法是检查抗体常用的办法。其原理为利用酶符号的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检查与固相抗原联系的受检抗体,故称为直接法(见图2-3)。操作进程如下:
1)将特异性抗原与固相载体联合,构成固相抗原。洗刷除掉未联系的抗原及杂质。
2)加稀释的受检血清,保温反响。血清中的特异抗体与固相抗原联系,构成固相抗原抗体复合物。经洗刷后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成份在洗刷进程中被洗去。
3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以ELISA试剂盒检查总抗体,但通常多用酶标抗人IgG检查IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体联系,然后直接地符号上酶。洗刷后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4)加底物显色
直接法成功的关键在于抗原的纯度。尽管有时用粗提抗原包被也能获得实践有用的结果,但应尽可能予以纯化,以进步实验的特异性。格外应留意除掉能与通常健康人血清发作反响的杂质,例如以E.Coli为工程酶的重组抗原,如其间富含E.Coli成份,很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发作反响。ELISA试剂盒抗原中也不能富含与酶标抗人Ig反响的物质,例如来自人血浆或人体安排的抗原,如不将其间的Ig去掉,实验中也发作假阳性反响。别的如抗原中富含无关蛋白,也会因竟争吸附而影响包被作用。
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