酵母感受态细胞

NMY51酵母感受态细胞说明书

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NMY51 Chemically Competent Cell说明书

产品货号： ML-G2041

保存条件： -80℃

产品规格: 10×100μl 50×100μl

产品介绍

基因型

MATahis3200trp1-901leu2-3,112ade2LYS2::(lexAop)4-HIS3ura3::(lexAop)8-lacZade2::(lexAop) 8-ADE2 GAL4

简要说明

MLBioDUALmembrane系统是DUALsystems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术，它利用分离的泛素系统（split-ubiquitin）直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用MLBio NMY51酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株Transformation marker为: trp1, leu2-3，报告基因为：HIS3, ADE2 和lacZ，第一步通过营养缺陷型报告基因（HIS3, ADE2）进行选择性生长筛选，进一步通过 LacZ 报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。原理：泛素（ubiquitin）分子量很小，由 76aa 残基组成；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的 N 端，然后被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分：N 端（Nub），C 端（Cub）。首先，人为地将泛素 Nub 的 3 位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI 突变为NubG）。这样与 Cub 的亲合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我结合或接近的可能性。其次，将Cub 部分与人工合成的 LexA-VP16 转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合，UBPs 也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成 bait 融合蛋（bait-cub-LexA -VP16）和 prey 融合蛋白（prey-NubG）。如果 bait 和 prey发生相互作用，就会促使 NubG 和 Cub 的相互接近，被 UBPs 识别，导致 LexA-VP16 的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。此系统可使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志均为LEU；三种Prey质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为TRP。MLBio High5TM系列NMY51感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，经PGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA 。

操作说明

1.取100 µl冰上融化的NMY51感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴，重复一次) 10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀，30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2.将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3.5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。

4.ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。

Preparation of Media：

YPDA （1L）:

Tryptone 20g

yeast extract 10g

0.2% adenine 15ml

补水到 950ml，用盐酸调PH到 6.5

Agar 20g (for plates only)

121度，15分钟高压灭菌，待培养基温度降到55度时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml

0.2% adenine(1L)

Adenine 2g

补水到1L，溶解后高压灭菌或0.22um滤膜过滤除菌

注意事项
1.MLBio感受态细胞最好在冰上融化。

2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4.NMY51酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。