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根癌农杆菌感受态细胞

GV3101农杆菌电转感受态细胞

GV3101农杆菌电转感受态细胞

  • 产品货号:ML-G2034
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GV3101农杆菌电转感受态细胞说明书

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GV3101 Electroporation-Competent Cell说明书
 
产品货号: ML-G2034                    

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产品规格:  10×50μl  50×50μl

产品介绍
              
基   因   型
C58 (rif R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR/strepR) Nopaline
 
简  要  说  明
MLBioGV3101菌株为C58型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签:Strep和gent,赋予GV3101菌株链霉素和庆大霉素抗性,适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。MLBio开发的GV3101电转感受态特别适用于大质粒的转化:经pCAMBIA2301质粒(size:11633bp)检测转化效率可达5×104cfu/μg;经pCAMBIA2301-ZH质粒(size:40kd)检测转化效率可达5×103cfu/μg。
 
操  作  说  明
1.0.2cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
2.取-80℃保存的MLBio农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入1-5ug质粒DNA(质粒体积不大于6ul,最好用试剂盒抽提,双蒸水溶解),用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用200ul枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。
3.启动电转仪,设置参数:C=25uF,PC=200ohm,V=2400V(此参数为MLBio推荐,使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中,加入700ul 无抗生素的LB并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。
4.6000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天(当平板只含有50ug/ml kan 时,28℃培养48h即可;平板中同时加入50ug/ml kan,20ug/ml rif 时,需28℃培养60h;如果使用的平板含有50ug/ml rif 则需要28℃培养72-90h)。
 
注 意 事 项
1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2.混入质粒时应轻柔操作,转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板同时含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
4.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。
 
备      注
1、农杆菌相关抗生素配方:
 

抗生素

配方

原液浓度

工作浓度

羧苄青霉素 (carb)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/m

50 μg/ml

硫酸卡那霉素 (kan)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

链霉素 (strep)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

50 μg/ml

利福平 (rif)

DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

20 μg/ml

庆大霉素 (gent)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

20 mg/ml

40 μg/ml

 
2、常用农杆菌抗性: (R:抗;S:敏感。)
 

农杆菌菌株

羧苄青霉素(carb)

链霉素(strep)

利福平(rif)

庆大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

R

R

S

S

EHA101

S

R

R

S

R

EHA105

S

R

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101 S

S

R

R

R

S

3、LB及YEB配方:

component

LB(液体)/L

LB(固体)/L

component

YEB(液体)/L

YEB(固体)/L

Yeast extract

5 g

5 g

Yeast extract

1 g

1 g

NaCl

10 g

10 g

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