BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell说明书产品货号: ML-G27004
保存条件: -80℃
产品规格: 5×50μl 50×50μl
产品介绍基 因 型endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (Strr) [pAdEasy-1 (Ampr)]简 要 说 明BJ5183-AD-1 是携带了腺病毒质粒pAdeasy-1 的BJ5183菌株。-MLBioBJ5183 菌株是一种具有较高重组活力的大肠杆菌菌株,是目前腺病毒系统最常用的感受态细胞。BJ5183 菌株含有 sbcBC recBC 双重突变,赋予 BJ5183 细胞较强的重组能力,有利于转入的目的基因与腺病毒骨架质粒的重组。endA1(缺失核酸内切酶)的突变有利于重组 DNA 的稳定和高纯度质粒 DNA 的提取。BJ5183-AD-1菌株细胞中已经提前转入了腺病毒质粒 pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)],赋予该菌株氨苄抗性,在病毒质粒构建时,只需转入线性化的目的质粒即可,简化了实验步骤,提高了病毒质粒重组概率。Strr 赋予 BJ5183-AD-1菌株链霉素抗性。BJ5183-AD-1 电击感受态细胞适用于普通质粒和大质粒的构建,经特殊工艺制作,pCAMBIA2301 质粒(size:1163bp)检测转化效率>1×106 cfu/μg DNA。操 作 说 明1.0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5分钟,待其沥干水分,正置 5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面 0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置 5分钟充分降温。2.取-80℃保存的BJ5183-AD-1电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的 DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP 管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19;B. 对于连接产物,请用乙醇沉淀DNA 后加入适量 TE缓冲液 (10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重悬,DNA 浓度不超过100ng/μl,体积不超过 5μl/50μl 感受态3.用200 μl枪头将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。4.启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为 BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用 电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。5.立即 向电击杯中加入1000 μl不含抗生素的无菌培养基 S.O.C.,混匀后转移到空50ml管中,并用1ml SOC轻柔冲洗电转杯并转移到50ml管中,另补加3ml SOC培养基, 37℃,200 rpm复苏60分钟。6.5000 rpm 离心一分钟收菌,重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的 S.O.C 平板上(因菌量较大, 若全部涂板请选用直径 15cm 培养皿 2-5 个)。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养过夜。注 意 事 项1.加入DNA 时体积不应大于感受态体积的1/10。2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。3.当DNA 不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。4.电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。5.若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。6.对于连接产物转化, 最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重悬产物,保证 DNA 浓度不超过 100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。7.混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头 (普通 200ul 枪头应剪去枪头尖0.6cm)避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。8.电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
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