<div> </div>
<div><strong>细胞名称<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-size: medium;"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong><a href="http://www.mlbio.cn"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><u><strong><span style="font-size: medium;">MOC1细胞系</span></strong></u></span></a></div>
<div> </div>
<div><strong>T150烧瓶<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>07-200-64</div>
<div> </div>
<div><strong>T75烧瓶<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>10-126-37</div>
<div> </div>
<div><strong>冷 冻 剂<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>03-374-059</div>
<div> </div>
<div><strong>45um过滤器<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>09-754-21</div>
<div> </div>
<div><strong>05%胰蛋白酶<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>sh30236.01</div>
<div><strong> </strong></div>
<div><strong>25%胰蛋白酶<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>sh30042.01</div>
<div> </div>
<div><strong>惰性谱线<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>MOC1,22</div>
<div> </div>
<div><strong>侵略性线<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>MOC2</div>
<div> </div>
<div><strong>IMDM<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>sh30228.02 Hams</div>
<div> </div>
<div><strong>营养混合物<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>F10-F12sh30026.01胎牛血清,特征-海克隆</div>
<div> </div>
<div><strong>目录 / 批次号<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>sh30071.03 / AWK24001</div>
<div> </div>
<div><strong>过滤1L过滤器瓶的过滤器<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>09-761-108</div>
<div> </div>
<div><strong>科学试剂目录编号<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>胰岛素:I6634-50mg 氢化可的松:H0135-1mg </div>
<div> </div>
<div><strong>EMD微孔试剂目录编号<strong style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(73, 73, 73); font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> : </strong><span style="font-size: medium;"><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><span style="font-family: Arial, 宋体, "Microsoft Yahei";"> </span></span></span></strong>表皮生长因子<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>EGF<font face="微软雅黑"><span style="font-size: 14px;">)</span></font>,重组人:01-107</div>
<div> </div>
<div><strong>解冻细胞系</strong><br />
<strong>1. </strong>在解冻前,将21ml IMDM MOC线培养基加入到T150中<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>如果想解冻成T75,则将10ml加入到T75 中)</div>
<div><strong>2.</strong> 将液氮从冷冻瓶中取出,喷上含有70%酒精的小瓶进行清洗。</div>
<div><strong>3. </strong>将冷冻瓶的下半部分放在37摄氏度的水浴中<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>不让盖子接触水,以避免污染),直到 有一小块冰漂浮着。</div>
<div><strong>4. </strong>再次用ETOH喷洒冷冻瓶,然后放在引擎盖上。将1ml培养液移液管加入到1ml细胞中,并将这 些2ml加入到已经含有培养基的T150中<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>使一个T150总共有22ml<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>。</div>
<div><strong>5. </strong>在T150烧瓶中取一些培养基,冲洗冷冻瓶,然后平板放置,以确保所有残留的细胞都留在冷 冻瓶中。</div>
<div><br />
<strong>冷冻细胞系</strong><br />
<strong>1. </strong>从T150中收集细胞,如下图所示</div>
<div><strong>2. </strong>在15ml锥形管中旋转成颗粒<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>1000 RPM x5分钟) </div>
<div><strong>3. </strong>排出上清液</div>
<div><strong>4.</strong> 点击15ml圆锥形管,重悬细胞</div>
<div><strong>5.</strong> 加入1.5ml IMDM MOC系培养基,在培养基中重建细胞-保持冰上</div>
<div><strong>6.</strong> 管入冰时缓慢加入1.5 ml冷冻介质<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>在IMDM MOC线介质中制作冷冻介质-20%DMSO。例:20ml库存-加入16ml IMDM MOC线培养 基和4ml DMSO。注射器过滤器,使用um过滤器</div>
<div><strong>7. </strong>每份1毫升到3个冷冻瓶</div>
<div><strong>8. </strong>在-80摄氏度内储存不超过2周</div>
<div><strong>9. </strong>在1-2周内放入液氮溶液中</div>
<div><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><strong>注 :</strong> </span>如果需要,可增加到2ml IMDM和2ml冷冻培养基,以储存在4个小瓶中。此外,最好在冷冻细胞 前计数细胞并记录在小瓶上。</div>
<div> </div>
<div><strong>细胞系特征</strong><br />
<strong>1. </strong>惰性- MOC1:基于体内研究的侵袭性较低。如果从80%合流T150通过1:12,需要2-4天才能达到80%合 流。与更具侵袭性的细胞系相比,MOC1细胞系在收获时需要的时间更长。</div>
<div><strong>2. </strong>侵袭性- MOC2:基于体内研究,更具侵袭性。如果从80%合流T150通过1:12,需要2-4天才能达到 80%合流。与惰性细胞系相比,惰性细胞系更容易从烧瓶中分离出来。</div>
<div><br />
<strong>从T150收集和传递细胞/80%融合</strong><br />
<strong>1. </strong>将T150中的介质倒入倾倒瓶中</div>
<div><strong>2. </strong>用10-20ml PBS清洗一次。倒出PBS清洗液。 </div>
<div><strong>3.</strong> 加入1.5ml 0.05%胰蛋白酶,尖端瓶,确保胰蛋白酶覆盖整个表面积,从而接触所有细胞<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>这样做,使细胞不会暴露在胰蛋白酶中太久<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>,排出胰蛋白酶,然后再应用1。5ml0.25%胰蛋 白酶。</div>
<div><strong>4. </strong>放置在37C培养箱中。侵袭性细胞系孵育3-4分钟,惰性反应可达10-12 min,但在6-8 min后 检查。<br />
<b>5. </b>故意敲击烧瓶一侧的手掌几次,使细胞松动。 </div>
<div><strong>6.</strong> 在显微镜下检查,看细胞在培养基中是否能自由漂浮。如果大多数没有,请放回37C培养箱中 再放置3-5分钟。尽量不要让细胞在胰蛋白酶中停留,因为这样会杀死细胞。 </div>
<div><strong>7. </strong>一旦所有或大部分细胞漂浮,加入10ml IMDM MOC线培养基来中和反应。</div>
<div><strong>8. </strong>移液管培养基和细胞从烧瓶中进入15ml的锥形细胞到颗粒细胞。离心机,1000 RPM x 5 min。 </div>
<div><strong>9. </strong>倒出上清液。</div>
<div><strong>10.</strong> 以1:12的速度通过细胞-在另外12毫升的培养基中重悬细胞。</div>
<div><b>11. </b> 从其中取出1ml,放入新的T150烧瓶中,总体积为22ml的IMDM MOC系培养基<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>稀释1:12) </div>
<div><strong>12. </strong>放回37C的培养箱中生长。应在2-4天内达到80%的合流率。</div>
<div><strong><br />
注入小鼠侧腹(异位)所需细胞浓度:</strong></div>
<div><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><strong>MOC1</strong><strong>:</strong></span><span style="color: rgb(0, 0, 0);">MOC22:</span><span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>用0.15ml注射1e6细胞)=6.66e6细胞/ml</div>
<div><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><strong>MOC2:</strong></span><span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>用0.15ml注射1e5细胞<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>=6.66e5细胞/ml </div>
<div><strong>1.</strong> 用0获取细胞。25%的胰蛋白酶,如上所述。</div>
<div><strong>2. </strong>用IMDM MOC系培养基中和胰蛋白酶后,将细胞旋转成50ml锥形的颗粒<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>1000 RPM x5分钟<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>。 注:使用50ml锥形,允许小尺寸针抽出细胞供注射。</div>
<div><strong>3.</strong> 用10ml冰水PBS重悬细胞颗粒<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>确保尽可能多地去除含有FCS的介质<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>,再次将细胞旋转成颗 粒<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>1000 RPM x5分钟<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span></div>
<div><strong>4.</strong> 用3-6 ml冰PBS重悬细胞颗粒再次清洗细胞<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>体积取决于颗粒的大小,因为你将使用这个体积 来计数细胞)</div>
<div><strong>5.</strong> 使用血细胞计数仪或自动细胞计数器计数每毫升的细胞,使用台盼蓝来消除死亡细胞。使用 存在的细胞总数<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>细胞/mlx总PBS的mlPBS<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>,计算重悬细胞颗粒所需的体积,以达到6.66e6<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>MOC1,MOC22<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>或6. 66e5 cell/ml<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>MOC2<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>浓度。</div>
<div><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><strong>例如:</strong></span>MOC1的细胞计数为: 2.8e6细胞/mlx5ml<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>PBS<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>=14e6细胞总数。14e6细胞/ 6.66e6细胞/ml=2.1mlPBS将细胞颗粒悬浮在其中。</div>
<div><strong>6. </strong>再次将细胞旋转成小颗粒。倒出PBS上清液<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>不<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>。在计算体积的冰PBS中重悬颗粒以达到 适当的浓度,记住灌注上清后50ml锥形中还有 200ul。</div>
<div><strong>7. </strong>将50ml锥形冰转移,每只小鼠皮下注射0.15ml<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>150ul<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 14px;">)</span>细胞。</div>
<div><strong>8.</strong> 按照标准协议注入鼠标。我们用1毫升注射器。我们用1.5英寸21号针绘制细胞,并将针切换 到½英寸26号针进行注射。</div>
<div><strong><br />
1L媒体协议</strong><br />
<span style="color: rgb(51, 153, 102);"><strong>将培养基为2:1 IMDM制成营养混合物</strong></span></div>
<div><strong>1. </strong>解冻胎牛血清和宾州/链球菌在37摄氏度</div>
<div><strong>2. </strong>1L过滤瓶加入626ml IMDM和313ml营养混合物</div>
<div><strong>3. </strong>添加50毫升FCS</div>
<div><strong>4. </strong>添加10ml Penn流</div>
<div><strong>5. </strong>过滤器</div>
<div><strong>6. </strong>加入1ml5mg/ml胰岛素<span style="font-family: 微软雅黑; font-size: 10.5pt;">(</span>或500ul,10mg/ml)</div>
<div><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><strong>注:</strong></span>用10ml无菌H20稀释胰岛素50mg粉末,加50ul无菌1N盐酸,4C箔保存</div>
<div><strong>7. </strong>加入40ug氢化可的松</div>
<div><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><strong>注:</strong></span>将Sigma中氢化可的松酮稀释1mg氢化可的松粉制成19ml无血清IMDM和1ml 100%乙醇,制成20ml。每升使用800ul。在-20处存储等分。</div>
<div><strong>8. </strong>添加5ug EGF</div>
<div><span style="color: rgb(51, 153, 102);"><strong>注:</strong></span>使EGF - make 1ug/ul原液用无血清IMDM稀释,每升加入5ul。在-80处存储等分。</div>
<div> </div>
<p> </p>
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二、样本要求
在收集标本前都必须有一个完整的计划,必须清楚要检测的成份是否足够稳定。我们提倡新鲜标本尽早检测,对收集后当天就进行检测的标本,及时储存在4℃备用,如有特殊原因需要周期收集标本,请造模取材后,将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差,蛋白极易降解,直接影响实验质量,所以避免反复冻融。代测放免标本的客户取材前须向我司销售人员索要说明书,具体操作注意事项请与我司技术人员沟通。
液体类标本:标本必须为液体,不含沉淀。包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。
血清:室温血液自然凝固10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。收集上清。如有沉淀形成,应再次离心。
血浆:应根据试剂盒的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,加入10%(v/v)抗凝剂(0.1M柠檬酸钠或1%heparin
或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。如有沉淀形成,应再次离心。
尿液、胸腹水、脑脊液:用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。如有沉淀形成,应再次离心。
细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.0-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,缓冲液中可加入1μg/L蛋白酶抑制剂或50U/ml的Aprotinin(抑肽酶)。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清置于-20度或-70度保存,如有必要,可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测,其余冷冻备用。
三、寄标本时需注明以下情况:
1、标本编号;2、所测项目;3、是否做复孔;3、联系方式;4、实验后标本是否寄回。
客户须知:
客户应对所提供的材料及信息负责,如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。